鹽酸克倫特羅檢測試劑盒
使用說明書
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測尿樣、組織、飼料 等樣本中的鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLE），試劑盒由預(yù) 包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他 配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的鹽 酸克倫特羅和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗鹽酸克倫特羅 抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其 所含鹽酸克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣 本中鹽酸克倫特羅的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
尿液……………………………0.05ppb
組 織（處理法）……………0.2ppb
組 織（處理法二）……………0.05ppb
飼料……………………………0.5ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
克倫特羅………………………100%
特普他林………………………<1%
馬布特羅………………………<1%
溴布特羅………………………<1%
沙丁胺醇………………………<1%
萊克多巴胺……………………<1%
2.5 樣本回收率：
尿樣……………………………95%±10%
組織、飼料……………………85%±15%
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3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96 孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各 1ml
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液 A（白蓋）……………………6ml
底物液 B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X 濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
10X 復(fù)溶液(黃蓋)…………………50ml
說明書………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩 器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g） 4.2 微量移液器：單道 20µl-200µl，100µl-1000µl、多道 300µl
4.3 試劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃 HCl、乙腈、甲醇、正己 烷、無水硫酸鈉
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5 樣本處理
5.1 樣本處理須知：
實驗器具必須潔凈并使用次性吸頭，以避免污染干擾實 驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液 1：0.1M HCl 溶液
取 0.86ml 濃 HCl 加去離子水至 100ml。
配液 2：0.1M NaOH 溶液
稱取 0.4g NaOH 加去離子水至 100ml。
配液 3：乙腈-0.1M HCl 溶液
V 乙腈:V0.1M HCl =84:16。
配液 4：復(fù)溶液
將 10×復(fù)溶液用去離子水 10 倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶， 復(fù)溶液在 4℃環(huán)境可保存?zhèn)�月。
5.3 樣本處理步驟：
5.3.1 尿樣處理方法：
直接取 50µl 清亮尿樣進(jìn)行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng) 4000r/min 離心 5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng) 冷凍保存。
尿樣本稀釋倍數(shù)：1
檢測下限：0.05ppb
5.3.2 組織樣本處理方法：
稱取均質(zhì)后的組織樣本 2±0.05g ，加入 6ml 復(fù)溶液，充分 振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min (若組織樣本中油 脂含量較高，可在振蕩后放入 85℃水浴 10min 后再離心)。取 50µl 上清液進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4
檢測下限：0.2ppb
5.3.3 組織樣本處理方法二：
1）稱取均質(zhì)后的組織樣本 2±0.05g ，加入 6ml 乙腈-0.1M HCl， 充分振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min。
2）取上清液 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 乙酸乙酯， 充分振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min，取全部上清 在 50-60℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥；
3）加入 1ml 復(fù)溶液混合振蕩 30s，取 50µl 進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
檢測下限：0.05ppb
5.3.4 飼料樣本處理方法：
1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品 1.0±0.05g，加入 10ml 甲醇，再加 入 5g 無水硫酸鈉，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；
2）吸出離心后的上清液 1ml，于 50-60℃氮氣或空氣流吹干， 用 1 ml 復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入 1mL 正己烷混合 30s； 室溫 4000r/min 以上離心 5min。
3）取 50µl 下層進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：10
檢測下限：0.5ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解， 每種液體試劑使用均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框 架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。實驗開始，用去離子水將 20×濃縮洗滌液按 20 倍稀釋 成工作洗滌液。
6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本 和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然 后加酶標(biāo)記物 50µl/孔，再加入 50µl/孔的抗體工作液，用蓋 板膜封板，輕輕振蕩 5 混勻，25℃反應(yīng) 30 分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗 滌液 250µl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 ，用吸水紙拍干 （拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液 A 50µl，再加底物液 B 50µl， 輕輕振蕩 5 混勻，25℃避光顯色 15 分鐘。
6.5 終 止：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，終止反 應(yīng)。
6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議 用雙波長 450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸 光度值的平均值（雙孔）除以第個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度 值，再乘以 100%，即 百分吸光度值（%）＝ A ×100% A0 A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 A0—0ppb 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算 以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb） 的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分 吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃 度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。 若利用試劑盒業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的 準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�
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8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致 所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲 線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行 下步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很 大程度上取決于洗板的致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試 劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標(biāo)準(zhǔn)的吸光 度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
原創(chuàng)作者：上海極威生物科技有限公司
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王小姐
