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動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞色素C釋放凋亡檢測(cè)試劑盒（含抗體）產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞色素C釋放凋亡檢測(cè)試劑（含抗體）是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或活體組織中分離出線粒體和細(xì)胞漿組分，從而檢測(cè)細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)運(yùn)，即由線粒體釋放到細(xì)胞漿，來探測(cè)細(xì)胞凋亡的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞漿組分的制備。可以被用于后續(xù)蛋白質(zhì)西方雜交等實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離到位，質(zhì)量保證。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素C（CYTOCHROME C）在細(xì)胞凋亡中扮演著重要作用。細(xì)胞色素C位于線粒體內(nèi)外膜之間。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，它從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞漿里，引起一系列的信號(hào)通道的下游反應(yīng)。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  毫升

裂解液（Reagent B）  毫升

凈化液（Reagent C）  毫升

強(qiáng)化液（Reagent D）  毫升

保存液（Reagent E）  毫升

活性液（Reagent F）  微升

溶解液（Reagent G）  毫升

上樣液（Reagent H）  微升

抗體液（Reagent I）  微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）、活性液（Reagent F）和抗體液（Reagent I）在-20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細(xì)胞

硬組織處理液（Reagent I）：用于促進(jìn)硬組織表面溶解

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、動(dòng)物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)5）

9． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

10． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

11． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

12． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

14． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

15． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

16． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

17． 渦旋震蕩15秒

18． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

19． 渦旋震蕩60秒

20． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

21． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

22． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

23． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒 GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

二、動(dòng)物軟組織線粒體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入一個(gè)液氮凍存管

5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（*快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

8． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

11． 加入預(yù)冷的xx微升強(qiáng)化液（Reagent D）

12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)6）

14． 加入預(yù)冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混勻

15． 放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

16． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

17． 放入4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

18． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

19． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

20． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

21． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

22． 渦旋震蕩15秒

23． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

24． 渦旋震蕩60秒

25． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

26． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

27． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

28． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒－GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

三、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（細(xì)胞勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱3分種

5． 手擊振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

6． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液

7． 合并移入到1個(gè)50毫升錐形離心管

8． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

9． 小心抽去上清液

10． 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

11． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

14． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

15． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化細(xì)胞（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)5）

16． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

17． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

18． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

19． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

20． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

21． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

22． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

23． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

24． 渦旋震蕩15秒

25． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

26． 渦旋震蕩60秒

27． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

28． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

29． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

30． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒－GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

四、動(dòng)物細(xì)胞線粒體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱3分種

5． 手擊振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

6． 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液

7． 合并移入到1個(gè)50毫升錐形離心管

8． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

9． 小心抽去上清液

10． 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）

11． 放入臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

12． 小心抽去上清液

13． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

14． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

15． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

16． 加入預(yù)冷的xx微升強(qiáng)化液（Reagent D）

17． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

18． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)6）

19． 加入預(yù)冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混勻

20． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

21． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

22． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

23． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

24． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

25． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

26． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

27． 渦旋震蕩15秒

28． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

29． 渦旋震蕩60秒

30． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

31． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

32． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

33． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)臺(tái)式微型離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒－GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

五、動(dòng)物硬組織線粒體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（xx克組織需要xx毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的xx毫升硬組織處理液（Reagent J），充分混勻

7． 放進(jìn)冰槽里孵育3分鐘

8． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g

9． 小心抽去上清液

10． 加入預(yù)冷的xx毫升清理液（Reagent A）和xx毫升 凈化液（Reagent C），充分混勻

11． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g

12． 小心抽去上清液

13． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

14． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

15． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)5）

16． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

17． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

18． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

19． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

20． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

21． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

22． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

23． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

24． 渦旋震蕩15秒

25． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

26． 渦旋震蕩60秒

27． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

28． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

29． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

30． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒－GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

六、動(dòng)物硬組織線粒體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent F）凍融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升凈化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，放進(jìn)冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（注意：實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入一個(gè)液氮凍存管

5． 即刻放入液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（*快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

8． 加入預(yù)冷的5毫升硬組織處理液（Reagent J），充分混勻

9． 放進(jìn)冰槽里孵育3分鐘

10． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g

11． 小心抽去上清液

12． 加入預(yù)冷的xx毫升清理液（Reagent A）和xx毫升 凈化液（Reagent C），充分混勻

13． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為1000g

14． 小心抽去上清液

15． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液

16． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

17． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

18． 加入預(yù)冷的xx微升強(qiáng)化液（Reagent D）

19． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

20． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)6）

21． 加入預(yù)冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混勻

22． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g

23． 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞

24． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

25． 小心移取上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管――此步驟獲得細(xì)胞漿組分

26． 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里備用

27． 保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物

28． 加入xx微升溶解液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中

29． 渦旋震蕩15秒

30． 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘

31． 渦旋震蕩60秒

32． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）

33． 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)

34． 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，即刻保存在－70℃冰箱里備用

35． 繼續(xù)進(jìn)行下列操作

操作一、可溶性線粒體和細(xì)胞漿總蛋白定量檢測(cè)

1） 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

操作二、可溶性線粒體和細(xì)胞漿蛋白電泳

1） 分別移取20微升（總量10微克）線粒體和細(xì)胞漿蛋白溶液（總量50微克）到新的1.5毫升離心管

2） 加入xx微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4） 放進(jìn)臺(tái)式微型離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）

5） 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作（12％SDS-PAGE）

7） 使用xx微升抗體液（Reagent I）進(jìn)行西方雜交（注意：建議使用蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒－GMS30005.1）

8） 比較細(xì)胞色素C的濃度變化和差異

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次操作（1克動(dòng)物組織或5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）

5． 通常勻化次數(shù)為80下達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

6． 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)

7． 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

8． 5 X 10⁷細(xì)胞約1克重量

9． 建議使用足夠的細(xì)胞量

10． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間

11． 通常5 X 10⁷細(xì)胞或1克動(dòng)物組織的線粒體含量為50微克線粒體蛋白

12． 建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒（GMS30030.1）測(cè)定蛋白濃度

13． 保存在－70℃冰箱里的蛋白樣品嚴(yán)格避免反復(fù)凍融

14． 加入10微升抗體液（Reagent I）到5毫升體系里，為兔抗單克隆抗體，可以用于檢測(cè)人、小鼠、大鼠、兔、馬、雞、牛等。二抗需使用抗兔二抗

15． 抗體液（Reagent I）適合5次Western Blot實(shí)驗(yàn)

16． 本公司提供系列細(xì)胞色素C試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶

使用承諾

杰美基因秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

訂購(gòu)信息

單組分訂購(gòu)信息

編號(hào)名稱規(guī)格

GMS10042.1.2動(dòng)物細(xì)胞/組織細(xì)胞色素C釋放凋亡檢測(cè)試劑盒（含抗體）10次

GMS10042.1.2A清理液（Reagent A）毫升

GMS10042.1.2B裂解液（Reagent B）毫升

GMS10042.1.2C凈化液（Reagent C）毫升

GMS10042.1.2D強(qiáng)化液（Reagent D）毫升

GMS10042.1.2E保存液（Reagent E）毫升

GMS10042.1.2F活性液（Reagent F）毫升

GMS10042.1.2G溶解液（Reagent G）毫升

GMS10042.1.2H上樣液（Reagent H）毫升

GMS10042.1.2I抗體液（Reagent I）微升

GMS10042.1.2J 硬組織處理液（Reagent J）毫升

GMS12028  HANK平衡鹽溶液毫升

GMS12033 PBS溶液毫升

GMS12024胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液毫升

GMS12052 DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基毫升

GMS30030.1 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒100次

GMS30005.1蛋白質(zhì)西方雜交印跡（化學(xué)發(fā)光）試劑盒5次

試劑盒訂購(gòu)信息