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· 所屬分類:應(yīng)用方法
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· 資料簡介:
活體細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能(膜電位)熒光測定試劑是一種旨在通過高度敏感的陽離子熒光羰花青染料結(jié)合到線粒體基質(zhì),其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體膜電位的變化,即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低,來分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種線粒體制備物的功能檢測?梢员挥糜诩(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,活體檢測,操作極為簡易,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
陽離子熒光羰花青染色劑JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是一種對膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進(jìn)入線粒體,分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高,JC-1形成聚集體,而濃度高,熒光顯色為紅色或桔紅色;反之,則為綠色。熒光減弱表明線粒體內(nèi)膜功能受到損害。
產(chǎn)品內(nèi)容
染色液(Reagent A) 微升
稀釋液(Reagent B) 毫升
清理液(Reagent C) 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存清理液(Reagent C)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;染色液(Reagent A)避免光照;有效保證6月
用戶自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(G&VS12024):用于細(xì)胞脫離
完全細(xì)胞培養(yǎng)液(G&VS12052):用于細(xì)胞脫落收集
1.5毫升離心管:用于活體細(xì)胞線粒體染色的容器
微型臺(tái)式離心機(jī):用于細(xì)胞收集的操作
培養(yǎng)箱:用于染色孵育
(共聚焦)熒光顯微鏡:用于活體細(xì)胞線粒體熒光定性分析
比色皿或96孔板:用于熒光定量分析的容器
熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀:用于活體細(xì)胞線粒體熒光定量分析
細(xì)胞流式儀:用于活體細(xì)胞線粒體熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent A)置入冰槽里融化,稀釋液(Reagent B)放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管,加入xx微升稀釋液(Reagent B),混勻后,在冰槽里靜置,并標(biāo)記為染色工作液,放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
一、直接法
1. 準(zhǔn)備1個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞,每孔鋪滿率達(dá)70%(約30萬細(xì)胞數(shù))
2. 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3. 輕輕沿著孔壁加入xx毫升 清理液(Reagent C)到細(xì)胞培養(yǎng)孔,覆蓋培養(yǎng)孔表面
4. 小心抽去xx毫升 清理液(Reagent C)
5. 加入xx微升含有染色液(Reagent A) 和稀釋液(Reagent B)的染色工作液,覆蓋培養(yǎng)孔表面
6. 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里,孵育20分鐘(注意避光)
7. 小心抽去xx微升染色工作液
8. 小心加入xx微升清理液(Reagent C)(注意:檢測前置于冰槽里)
9. 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(單濾波或雙濾波):
二、間接法
1. 準(zhǔn)備1個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞,每孔鋪滿率達(dá)70%(約30萬細(xì)胞數(shù))
2. 小心移出細(xì)胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管(收集懸浮細(xì)胞)
3. 加入xx毫升 清理液(Reagent C)到細(xì)胞培養(yǎng)孔,覆蓋培養(yǎng)孔表面
4. 小心移出xx毫升 清理液(Reagent C)到15毫升錐形離心管(收集洗脫細(xì)胞)
5. 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔表面
6. 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
7. 輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)板,使細(xì)胞脫落,然后加入1毫升完全細(xì)胞培養(yǎng)液
8. 移入15毫升錐形離心管
9. 放進(jìn) 臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
10. 小心抽去上清液
11. 加入xx微升清理液(Reagent C)
12. 用200微升槍頭上下輕柔抽吸,混勻細(xì)胞顆粒群
13. 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管或細(xì)胞流式儀專用測試管
14. 加入xx微升含有染色液(Reagent A) 和稀釋液(Reagent B)的染色工作液
15. 輕度渦旋震蕩2秒
16. 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里,孵育20分鐘(注意避光)
17. 放進(jìn) 臺(tái)式微型離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
18. 小心抽去上清液
19. 加入xx微升清理液(Reagent C)(注意:檢測前置于冰槽里)
上海極威生物科技有限公司(Shanghai JIwei Biological Technology Co., Ltd.)成立于上海,主營產(chǎn)品有elisa試劑盒,大鼠elisa試劑盒,小鼠elisa試劑盒,動(dòng)物血清,細(xì)胞株,標(biāo)準(zhǔn)品,生化試劑盒等。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)有酶聯(lián)免疫ELISA檢測、生化測試、液相氣相檢測、Icp-MS測試、載體構(gòu)建、RACE、全基因合成、線粒體測序、熒光定量PCR、基因克隆、定點(diǎn)突變、染色體步移、基因組全序列獲取、環(huán)境微生物多樣性、微生物基因組測序、微生物菌種鑒定、甲基化分析服務(wù)等。極威生物秉承以產(chǎn)品質(zhì)量為根本,以市場需求為導(dǎo)向,以為客戶創(chuàng)造價(jià)值為己任的精神,致力于發(fā)展中國的科研事業(yè)。
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